Определение содержания ДНК по окрашиванию дезоксирибозы (по Дишу)

Метод определения содержания ДНК основывается на свойстве дезоксирибозы образовывать с фенилаланином соединение синего цвета. Рибоза и РНК не препятствуют определению ДНК.

Ход работы

0,1- 0,5 г измельченного материала количественно переносят 0,5 н раствором НСЮ4.. Пробирку соединяют с прямым холодильником и помещают на 30 мин. на водяную баню для экстрагирования нуклеиновых кислот и их гидролиза до образования растворимых ферментов. Гидролизат охлаждают, центрифугируют и используют для определения ДНК.

Берут 1-2 мл гидролизата, добавляют двойной объем реактива Диша. Смесь нагревают в течение 10 мин. на водяной бане. Смесь окрашивается в синий цвет. После охлаждения определяют оптическую плотность при Х= 600 нм. Если раствор сильно окрашен, тогда его разбавляют в 2 раза реактивом Диша. Содержание ДНК рассчитывают по калибровочной кривой. Для построения калибровочной кривой используется стандартный раствор ДНК.

Оборудование и реактивы:

Центрифужные пробирки на 25-50 мл; холодильник; реактив Диша (1г дифенилаланина, дважды перекристаллизованного в собственном растворе в 70% этиловом спирте, растворяют в 100 мл концентрированной уксусной кислоты и добавляют 2,75 мл концентрированной серной кислоты); стандартный раствор ДНК (0,1-1,0 мг/мл); раствор 0,2 н и 0,5 н перхлорной кислоты.

Поделиться:
Добавить комментарий