Определение содержания ДНК по окрашиванию дезоксирибозы (по Дишу)
Метод определения содержания ДНК основывается на свойстве дезоксирибозы образовывать с фенилаланином соединение синего цвета. Рибоза и РНК не препятствуют определению ДНК.
Ход работы
0,1- 0,5 г измельченного материала количественно переносят 0,5 н раствором НС1O4. Пробирку соединяют с прямым холодильником и помещают на 30 минут на водяную баню для экстрагирования нуклеиновых кислот и их гидролиза до образования растворимых ферментов. Гидролизат охлаждают, центрифугируют и используют для определения ДНК.
Берут 1-2 мл гидролизата, добавляют двойной объем реактива Диша. Смесь нагревают в течение 10 минут на водяной бане. Смесь окрашивается в синий цвет. После охлаждения определяют оптическую плотность при λ= 600 нм. Если раствор сильно окрашен, тогда его разбавляют в 2 раза реактивом Диша. Содержание ДНК рассчитывают по калибровочной кривой. Для построения калибровочной кривой используется стандартный раствор ДНК.
Оборудование и реактивы:
- Центрифужные пробирки на 25-50 мл;
- холодильник;
- реактив Диша (1г дифенилаланина, дважды перекристаллизованного в собственном растворе в 70% этиловом спирте, растворяют в 100 мл концентрированной уксусной кислоты и добавляют 2,75 мл концентрированной серной кислоты);
- стандартный раствор ДНК (0,1-1,0 мг/мл);
- раствор 0,2 н и 0,5 н перхлорной кислоты.
