Разделение пигментов методом хроматографии на бумаге (по Сапожникову Д.).

Разделение смеси пигментов основывается на селективной абсорбции фильтровальной бумаги. Когда по бумаге под действием капиллярных сил движется раствор, молекулы его разделяются на две фазы в соответствии с их коэффициентом разделения (подвижная и неподвижная фазы).

Чем больше растворимость пигмента в мобильной фазе, тем дальше он продвинется по хроматографической бумаге вместе с растворителем.

Ход работы

1. Экстракция пигментов

Навеску в 2 г свежего растительного материала растереть в ступке с 1-2 мл смеси ацетона со спиртом в соотношении 3:1. Растертую массу количественно перенести на стеклянный фильтр № 3, отфильтровать на колбе Бунзена. Ступку и осадок на фильтре несколько раз промыть смесью ацетона со спиртом. Фильтрат количественно перенести в мерную колбу на 25 мл и довести смесью растворителей до метки, перемешать.

2. Разделение пигментов

Хроматографическую бумагу разрезать на прямоугольники 13 х 16 см (короткая сторона - по длине волокон) и подсушить в сушильном шкафу при температуре 50 °С. В нижней части бумаги, вдоль ее длинной стороны, тонким простым карандашом провести стартовую линию, отступив на 2,5 см от края бумаги.

2 мл вытяжки пигментов поместить в бюкс с притертой крышкой и с помощью капилляра (или медицинской пипетки) нанести постепенно раствор на стартовую линию равномерным слоем, подсушивая постоянно бумагу на воздухе. Хрома-тограмму свернуть трубочкой наружу той стороной, на которую нанесен раствор, и поместить в хроматографический цилиндр, содержащий 20 мл смеси петролейного эфира со спиртом (20:1). Уровень растворителей должен быть ниже стартового пятна. Цилиндр закрыть крышкой. Разделение считается оконченным, когда растворители поднимутся по бумаге вверх, не достигая 2-3 см до верхнего края.

  • Через 20-30 минут хрома-тограмму высушить в вытяжном шкафу каротин - цвет ярко-желтый;
  • продукты распада или неполного синтеза хлорофилла - цвет серо-зеленый или бурый;
  • хлорофилл "а" - цвет сине-зеленый; ксантофилл - цвет оранжевый; хлорофилл "Ь" - цвет желто-зеленый;

Разделение пигментов на хроматографической бумаге

Разделение пигментов на хроматографической бумаге.

Хроматограммы хранить в темноте.

Элюация и количественное определение пигментов.

Хроматограммы разрезать на полосы, содержащие конкретные пигменты, полосы измельчить и поместить в химические стаканы на 50 мл, смочить небольшим количеством серного эфира, затем отмывать смесью ацетона со спиртом (3:1). Экстракты слить в мерные колбы на 25 мл, раствор довести смесью растворителей до метки, перемешать. Определить оптические плотности растворов на ФЭК-М, используя определенные светофильтры (для хлорофиллов «а» и «Ь» - красный, для каротиноидов и ксантофиллов-синий). По калибровочной кривой найти соответствующую данной оптической плотности концентрацию в мг / мл (а).

Рассчитать содержание пигментов по формуле:

Рассчитать содержание пигментов по формуле

где п - число хроматограмм.

Оборудование и реактивы:

Сухой зеленый материал, спирт, ацетон, серный эфир, петролейный эфир, ступка с пестиком, колба Бунзена со стеклянным фильтром №3 и №4, электронасос, мерные колбы на 50 мл, 25 мл, хроматографическая бумага, пипетка, бюкс с крышкой, пипетка на 2 мл, ножницы, хроматографическии цилиндр с крышкой, химические стаканы на 50 мл, ФЭК - М.

Вопросы для повторения:

  • В чем сущность метода бумажной хроматографии?
  • За счет чего происходит разделение пигментов?
  • В какой последовательности распределяются пигменты на хроматограмме?
Поделиться:
Добавить комментарий