Проблемы адаптивной селекции в культуре in vitro (на примере томата).

Каллусообразование и регенерация у растений как количественные признаки.

Современный селекционный процесс растений невозможно представить без применения методов клеточной и генной инженерии. Одно из важнейших направлений в биотехнологии растений занимает клеточная селекция, при которой отбор клеточных линий и растений с новыми наследственными признаками производится на уровне культивируемых in vitro клеток (Глеба, Сытник, 1984; Сидоров, 1990). В связи с этим внимание исследователей привлечено к отработке методов культивирования и отбора растительных клеток, а также регенерации растений in vitro. Без успешной регенерации все технологии генной и клеточной инженерии не находят логического завершения. Установлено, что процессы каллусообразования и регенерации видо- и сортоспецифичны.

Отбор генотипов с высоким регенерационным потенциалом и вовлечение их в селекционный процесс будут способствовать результативности клеточной селекции. В связи с этим возникает задача изучения наследования регенерационных процессов растений наряду с другими количественными признаками. Т. С. Фадеева, Л. А. Лутова, О. Г. Козырева (1974), Т. С. Фадеева, О. Г. Козырева, Л. А. Лутова (1979) одними из первых начали исследование процесса регенерации растений как генетического признака.

Авторами при изучении генетических коллекций редиса и томатов выделены мутанты по типу регенерации. По их мнению, регенерация является стрессовой ситуацией, при которой раскрывается аварийная программа генотипа, способность к регенерации — одна из форм тканевой или организменной адаптации, наиболее полно характеризующей гомеостаз клеток и тканей.

Количественные признаки процессов органогенеза в культуре in vitro растений в настоящее время стали предметом генетического анализа. Проведен диаллельный анализ каллусообразования и регенерации у ряда культур:

цветной капусты (Buiatti et al., 1974);
перца (Novak, Kubalakova, 1978);
кукурузы (Nesticky et al., 1983);
тритикале (Charmet, Bernard, 1984);
огурца (Nadolska-Orczyk, Malepszy, 1989);
люцерны (Wan, Sorensen, Liang, 1988);
риса (Quimio, Zapato, 1990; Izurni et al., 1991; Toshinori, Yuzo, 1991).

Показаны видоспецифичность характера наследования признаков, влияние ядра и цитоплазмы на регенерационные процессы, а также возможность их усиления в результате гибридизации и отбора.

Ряд исследований по генетике каллусогенеза и регенерации выполнен у культуры томата. R. D. Locy (1983) изучил каллусогенез и регенерацию шести видов томата.

Каллус и регенерация развивались более успешно у видов L. peruvianum и L. glandulosum. S. Ohki, С. Bigot, J. Moussean (1978) выявили эффект гетерозиса между двумя линиями томата по способности к регенерации, а также установили влияние цитоплазмы на этот процесс. E. A. Frankenberger, P. M. Hasegawa, E. C. Tigchelaar (1981) провели диаллельный анализ способности к регенерации между шестью генотипами томата. Показана высокая наследуемость изучаемого признака. В большинстве гибридных комбинаций наблюдалось промежуточное наследование. Основную часть генетической изменчивости составили аддитивные эффекты, однако неаддитивные эффекты также были значимы. Анализ графика Хеймана показал, что в двух из трех генотипов с высокой способностью к регенерации этот признак детерминируется рецессивными генами.

M. M. Tan et al. (1987) не выявили эффекта гетерозиса по регенерационной способности у гибридов томата. M. Koorhneef, C. J. Hanhart, L. Martinelli (1987) изучали возможность передачи генов высокой регенерационной способности от вида L.peruvianum культурному томату. Выявлено, что способность к регенерации из каллуса наследуется двумя доминантными генами. Рост каллуса и способность к регенерации не коррелировали. Анализ литературы по наследованию каллусогенеза и регенерации у томата показывает противоречивость полученных результатов, что, вероятно, связано с разными объектами и методами исследований. Тем не менее поиск генотипов — доноров высокой способности к регенерации in vitro может значительно повысить эффективность методов клеточной инженерии томата.

Условия культивирования растений in vitro представляют собой совершенно уникальную совокупность сред для отбора генотипов, где реализуются генетические потенции клетки и ткани, но не целого растения.

Сложилось мнение, что в культуре in vitro можно вести селекцию только по тем признакам растения, которые проявляются на клеточном уровне (устойчивость к пониженным температурам, засухе, гербицидам, засолению и др.). В связи с этим возникает вопрос о взаимосвязи между проявлением признаков in vitro и in vivo. M. Nesticky et al. (1983) изучили связи между массой каллуса и хозяйственно ценными признаками инбредных линий и гибридов кукурузы. По отдельным признакам наблюдались достоверные корреляции, причем сила связи зависела от генотипов (линии, прямые или обратные гибриды). Можно предположить, что при селекции in vitro не исключена возможность сопряженного отбора по хозяйственно ценным признакам. Совершенно не изучена типичность среды in vitro по отношению к условиям in vivo. Кроме того, весьма интересно выявить возможность оценки адаптивной способности генотипов в культуре in vitro.

В связи с этим нами была поставлена задача изучить взаимодействие генотипа и среды в культуре in vitro у томата.

Были исследованы следующие вопросы:

анализ комбинационной способности генотипов томата по каллусообразованию и регенерации в различных условиях среды;
изучение генетической детерминации признаков томата in vitro в зависимости от условий культивирования;
оценка адаптивной способности генотипов томата и параметров среды для культивирования и отбора генотипов;
изучение связей между проявлением признаков in vitro и in vivo.

Исследовали 28 гибридов Fv полученных от 8 родительских форм в результате диаллельных скрещиваний.

Родителями служили следующие образцы:

Талалихин (1),
Доходный (2),
П7 (3),
Beta (4),
S.a.mini (5),
Линия 7 (6),
L. pimpinellifolium (7),
Torosa (8).

Изучался признак "масса каллуса" в мг. Для оценки комбинационной способности генотипов томата по изучаемому признаку использовалась питательная среда Мурасиге и Скуга (МС) (Murashige, Skoog, 1962).

Из ауксинов применялись 2,4-Д и НУК, из цитокининов — 6 БАП. В результате проведенной оптимизации сред для каллусообразования были подобраны оптимальные концентрации ауксинов и цитокининов (Кильчевский, Никонович, 1991, 1992). Генетика каллусогенеза изучалась на двух питательных средах:

МС; 6 БАП; 2,4-Д — 1 мг/л;
МС; 6 БАП; НУК — 1 мг/л.

Экспланты (семядоли) культивировались в чашках Петри в термостате при температуре 24 — 2б°С и при пониженной температуре 11 — 13°С. Повторность, опыта трехкратная по 8 эксплантов на чашку.

При изучении регенерационной способности томата также применялась среда Мурасиге и Скуга. Эксплантамн служили сегменты семядолей, полученные от растений томата в фазе начала образования первого листа в асептических условиях. Регенерационную способность исследовали на двух питательных средах:

МС; ИУК — 1 мг/л; кинетин — 1 мг/л;
МС; ИУК — 3,4 мг/л; 6 БАП — 2,2 мг/л.

Экспланты культивировались в стеклянных банках в культуральной комнате при температуре 24 — 26°С и двух вариантах освещенности: нормальной (5 — 6 тыс. люкс) и пониженной (1 — 2 тыс. люкс). Способность генотипа к регенерации определяли как число эксплантов, где отмечена регенерация, к общему числу эксплантов в процентах.

Для оценки типичности условий in vitro по отношению к условиям in vivo изучали массу каллуса 8 родительских сортов томата на 12 вариантах питательной среды МС при различной концентрации 6 БАП и НУК.

Генетические параметры изучаемых признаков оценивали по методике B. I. Hayman (1954), комбинационную способность образцов — по методу B. Griffing (1956), параметры адаптивной способности и экологической стабильности генотипов, среды как фона для отбора — по методу А. В. Кильчевского, Л. В. Хотылевой (1985а), А. В. Кильчевского (1986).