Получение фермента инвертазы и ее действие на сахарозу.
Углеводы, или сахара, составляют большой класс веществ и играют важную роль в обмене веществ. Простые углеводы - моносахариды, представляют собой альдегиды или кетоны многоатомных спиртов. Сложные углеводы - дисахариды и полисахариды, при гидролизе распадаются на простые углеводы.
Фермент (β-фруктофуранозидаза (старые названия - сахара за или инвертаза) катализирует процесс гидролиза сахарозы:
Этот фермент содержится в большинстве растений. Весьма активную (3-фруктофуранозидазу содержат клетки дрожжей.
Для изучения влияния внешних условий на активность Р-фруктофуранозидазы проводят следующий опыт: в несколько пробирок помещают одинаковое количество раствора фермента и одинаковое количество сахара и выдерживают пробирки при разных условиях. Через определенное время, равное для всех вариантов, во всех пробирках проводят реакцию с фелинговой жидкостью, которая восстанавливается при кипячении с глюкозой и фруктозой, но не реагирует с сахарозой. По количеству осадка Cu20 судят о количестве образовавшихся при гидролизе сахарозы моносахаридов. Поскольку количество фермента и субстрата (сахарозы) и продолжительность опыта во всех вариантах одинаковы, то количество продуктов реакции будет характеризовать активность фермента.
Ход работы
Поместить в ступку 5 г сухих дрожжей, добавить кварцевого песка или толченого стекла, 5 мл воды и тщательно растереть. Затем добавить еще 15 мл воды, нагретой до 40°С, и оставить на полчаса, продолжая время от времени растирание. Полученную жидкость отфильтровать дважды через бумажный фильтр. Полученный фильтрат содержит изучаемый нами фермент.
Для анализа приготовить 3 пробирки. В первую добавить 5 мл 20% раствора сахарозы (контроль); во вторую - 5 мл 20% раствора сахарозы и 1 мл фермента; в третью - 5 мл 20% раствора сахарозы и 1 мл предварительно прокипяченного фермента. Все три пробирки поместить в водяную баню на 15-20 минут при температуре 40°С. В это время происходит гидролиз сахарозы. Чтобы это доказать, готовим три колбы на 60 - 100 мл. Содержимое пробирок переносим в соответствующие колбы. В каждую добавляем по 10-20 мл раствора Фелинга (I) и 10-20 мл раствора Фелинга (П) и кипятим в течение 3 минут.
Сделать выводы относительно каждой пробирки.
Оборудование и реактивы:
- Сухие дрожжи;
- штатив с пробирками;
- воронка;
- песок;
- водяная баня;
- термометр;
- пипетки градуированные на 1-5-10 мл;
- весы; 20%-ный раствор сахарозы;
- растворы- Фелинга (I и И).
Ф I - 4%-ый раствор CuS04 • 5Н2O
Ф II - 20% C4H406KNa в 15%-ном растворе КОН, в соотношении 1:1
Вопросы для повторения:
- Какова роль углеводов в жизни растений?
- Каковы оптимальные условия для активности изучаемых ферментов?
