Гибель подопытных окуней в дистиллированной воде.
Показательны в этом отношении и опыты Г. А. Виноградова с соавторами, выполненные на окунях и карасях. Гибель подопытных окуней в дистиллированной воде при рН 3,7 наступала через 5 — 6 ч, а в дистиллированной воде после добавления 40 мг/л Са+2 время выживания увеличилось до 24 — 72 ч, т. е. в 5 — 12 раз. Напомним, что время выживания окуней, содержащихся в нормальной речной воде при рН 3,7, было более 5 сут. Добавление Са+2 в кислую дистиллированную воду (рН 3,6) оказывало защитное действие, т. е. резко снижало или полностью блокировало утечку Na+ из организма карасей уже через 30 мин после внесения ионов кальция. Максимальный защитный эффект был отмечен при внесении в кислую дистиллированную воду 65 мг/л Са+2 и выше. Более низкие концентрации кальция (10 — 20 мг/л) не влияли на повышенный выход Na из организма рыб. Правда, в другой работе, выполненной также на карасях, представлены несколько иные цифры. Оптимальный защитный эффект (снижение выхода Na+ из организма) отмечен при добавлении в кислую дистиллированную воду (рН 3,8) всего лишь 30 мг/л Са+2, и дальнейшее увеличение концентрации кальция (до 70 мг/л) практически не влияет на утечку Na+ через жабры, а уменьшение концентрации кальция ниже 10 мг/л вызывает резкое повышение проницаемости жабр у карася. Внесение кальция в кислую дистиллированную воду снижает выход натрия из организма карася более чем в 5 раз в сравнении с тем, что имеет место в дистиллированной воде при рН 6,8. Таким образом, экспериментальные данные показывают, что степень нарушения ионного обмена у рыб под влиянием низких рН зависит от концентрации ионов в наружной среде, в первую очередь Са+2 и Na+, добавление которых в дистиллированную воду продлевает время выживания рыб и снижает выраженность гипонатриемии. Все это однозначно свидетельствует о том, что ведущей причиной обессоливания организма рыб вследствие повышенной утечки ионов натрия является гипотоничность воды, в которой содержатся подопытные рыбы (либо дистиллированная, либо чрезвычайно мягкая с критически низким содержанием ионов Са+2), подострые величины рН лишь усугубляют этот процесс, но никак не являются его первопричиной.
Накопленные к настоящему времени экспериментальные данные не подтверждают мнение о том, что увеличение проницаемости жаберного эпителия для ионов и их повышенная утечка из организма, ведущая к гипопротеинемии, является характерной особенностью реакции рыб при летальных значениях низких рН среды.Мы уже подчеркивали,что обессоливание организма представляет собой адекватную реакцию рыб на помещение их в гипотоническую среду, и реакция эта резко усиливается при снижении величины рН в толерантном (обратимо) и летальном (необратимо) диапазонах. Помимо изменения ионного состава среды и увеличения ее кислотности, ряд других факторов, в том числе температура, а также некоторые токсиканты, увеличивают проницаемость жаберного эпителия, вызывая тем самым повышенную утечку ионов натрия из внешней среды. Исследованиями Дж. Метца и Ф. Гарсия-Ромеу на пресноводных рыбах и Д. Эванса на морских костистых рыбах установлено ингибирующее влияние избытка ионов аммония во внешней среде на активный транспорт Na+, а также стимуляция поглощения ионов натрия при введении NHJ в организм рыб. Эти данные свидетельствуют о том, что при определенных условиях экскреция аммония — одного из конечных продуктов азотистого обмена может быть сопряжена у рыб с поглощением натрия из внешней среды (Na+ = NH — обмен), который наряду с основным Na+ = Н+ — обменом играет важную роль в поддержании кислотно-щелочного гомеостаза в организме рыб. Правда, в дальнейшем были получены противоречивые данные относительно влияния избытка ионов аммония на поглощение и выведение Na+ у рыб. По мнению Г. А. Виноградова, соли аммония не оказывают влияния на процессы регуляции Na+ у карася и окуня, что не согласуется с исходными наблюдениями Дж. Метца и Ф. Гарсия-Ромеу, проведенными на карасе. Однако у другого пресноводного вида — девятииглой колюшки Г. А. Виноградов и другие специалисты обнаружили влияние аммония в концентрациях 1 и 4 мг-экв./л как на поглощение, так и на выведение Na+ из организма рыб.
Помимо солей аммония, другим существенным загрязнителем рыбохозяйственных водоемов является полихлорпинен.
Он оказывает выраженное влияние на проницаемость жаберного эпителия для ионов натрия. Увеличение уровня проницаемости у подопытных карасей, сопровождающееся повышенной утечкой ионов натрия, отмечено как при летальных концентрациях полихлорпинена (0,5; 0,2; 0,1 мг/л), так и сублетальных (0,02 мг/л). Авторы считают, что под влиянием полихлорпинена активный транспорт натрия не нарушается, однако скорость потери настолько велика, что организм не в состоянии скомпенсировать ее путем реабсорбции натрия.
Таким образом, критический анализ имеющихся экспериментальных данных приводит к необходимости сделать вывод о том, что необратимое нарушение осморегуляторной функции жабр рыб, в частности угнетение поглощения и многократное увеличение выведения натрия, является неспецифической реакцией, развивающейся в ответ на действие того или иного повреждающего фактора, вызывающее деструктивные изменения жаберного эпителия. Одним из таких факторов является летально высокая концентрация водородных ионов, вызывающая некомпенсируемую патологическую утечку солей из организма пресноводных рыб. Особо следует подчеркнуть, что необратимые изменения проницаемости жаберного эпителия и снижение концентрации электролитов в крови рыб развиваются только при летально низких величинах рН и наличии выраженного симпотом комплекса кислотного отравления, т. е. носят вторичный характер и не могут быть приняты в качестве единственной или даже основной причины кислотного отравления и гибели рыб. Иными словами, повышенная утечка ионов натрия из организма рыб при кислотном отравлении может быть лишь одной из причин гибели рыб, наряду с другими, в том числе, или прежде всего, наряду с развивающейся гипоксией.
Свидетельством тому служат прямые экспериментальные данные, по: лученные Г. Ульчем, М. Оттом и Н. Хейслером при изучении физиолого-биохимических изменений в организме карпа под влиянием снижения величины рН воды в толерантном и летальном диапазонах (5,1; 4,0 и 3,5). Особая ценность этой работы состоит в том, что в ней впервые представлены результаты параллельного изучения показателей состояния каждой из трех основных функций жаберного аппарата: дыхательной, осморегуляторной и экскреторной, обеспечивающей сохранение кислотно-щелочного равновесия. Авторы исследовали напряжение кислорода (р02), величину рН и концентрацию лактата в крови, ее щелочной резерв и содержание ионов Na+, К и СГ в дорзальной аорте, а также экскрецию ионов аммония у карпов, подвергнутых различным по силе кислотным нагрузкам путем быстрого снижения рН воды с 7,4 до 5,1, с 5,1 до 4,0 и с 4,0 до 3,5.
Согласно полученным данным при снижении рН с 7,4 до 5,1 основные показатели кислотно-щелочного и ионного равновесия практически не изменились у подопытных рыб и лишь несколько снизился щелочной резерв крови. По мнению авторов, утечка оснований вызывает нарушение кислотно-щелочного равновесия крови рыб при низком рН воды. Новое снижение щелочного резерва плазмы крови отмечено у рыб при рН воды 4,0. Одновременно с этим происходит постепенное снижение величины рН артериальной крови и содержания в ней ионов бикарбоната. Вследствие угнетения работы ионообменных насосов (Na+ =Н+иСП= НСОз) снижается концентрация ионов натрия и хлора и повышается концентрация К в крови. Повышение концентрации К+ в крови ручьевой форели при рН воды 4,2 было отмечено ранее Дж. Дайвли с соавторами и вызвано, по-видимому, выходом внутриклеточного калия в обмен на поступление ионов водорода в клетки.
Снижение рН воды с 4,0 до 3,5, т. е. до остро летального уровня (гибель рыб в течение 5,2 ч), приводило к некоторому дополнительному падению концентрации ионов в плазме крови в сравнении с тем,,что отмечено при рН 4,0, и значительному снижению рН крови (на 0,65 единицы) в течение 2 ч экспозиции, т. е. на 2/3 суммарного отклонения этого показателя i от нормы, характерной для карпа при рН воды 7,4. Основной причиной закисления крови рыб при летально высокой концентрации водородных ионов в воде авторы считают резкое повышение рСO2 крови и дальнейшее снижение содержания бикарбоната и повышение концентрации лактата в крови. Количественная оценка вентиляции жабр при кислотном отравлении не проводилась, однако частота и глубина дыхания постепенно снижались вплоть до момента гибели рыб. Авторы считают, что повышение рСO2 в крови обусловлено нарушением внешнего дыхания, которое усугублялось избыточным накоплением слизи на жабрах, ведущим к дополнительному угнетению газообмена и затруднениям в перфузии жабр. Непосредственное определение р02 артериальной крови у подопытных карпов, содержащихся при рН воды 5,1 и 4,0, показало, что оно было достаточным для снабжения тканей кислородом. Закисление воды до рН 4,0 не оказывало заметного влияния на стандартный обмен, потребление кислорода и его транспорт к тканям. Лактат крови, представляющий собой наиболее демонстративный индикатор уровня обеспеченности тканей кислородом и развивающейся под влиянием того или иного фактора гипоксии, оставался у рыб низким при рН воды 5,1 и 4,0. Таким образом, все показатели уровня обеспеченности организма рыб кислородом при снижении рН до 5,1 и даже до 4,0 оставались в пределах "нормы реакции", если не считать незначительного и кратковременного увеличения содержания лактата крови до 2 ммоль при рН воды 4,0.
Принципиально иная картина выявлена у рыб при рН воды 3,5. В этих условиях происходит резкое снижение потребления кислорода и транспорта его из жабр в ткани рыб. Содержание кислорода в крови становится намного ниже нормального уровня, что обусловлено как нарушением газообмена в жабрах вследствие увеличения слоя слизи на поверхности филоментов и увеличения диффузионного барьера, так и снижением эффективности транспортной функции гемоглобина (эффект Бора) и кислородной емкости крови (эффект Рута). Действительно, величина рН крови подопытных рыб незадолго до их гибели снижается до 6,91 ±0,05. В этих условиях способность крови транспортировать кислород резко нарушается, что ведет к развитию эндогенной гипоксии. Напомним, что ранее Р. Джонс и другие специалисты отметили гибель радужной форели после снижения рН крови до 6,8 — 6,9 вследствие введения молочной кислоты в кровяное русло. Решающим доказательством возникновения тканевой гипоксии у подопытных карпов при кислотном отравлении и снижении рН крови до 6,9 служит резкое увеличение содержания в крови молочной кислоты — до 8 ммоль. Конечно, требуются дополнительные исследования, чтобы ответить на вопрос о том, является ли гипоксия, развивающаяся при кислотном отравлении рыб, прямым или косвенным следствием изменения рН крови, однако снижение потребления кислорода и развивающаяся гипоксия, ярким проявлением которой является чрезвычайно низкое напряжение кислорода в артериальной крови и резко увеличившееся содержание лактата в крови, являются, по мнению Г. Ульча и других специалистов, основным фактором, лимитирующим выживание рыб.
Этот вывод тем более знаменателен, что сделан авторами, которые одно время оспаривали значение гипоксии в качестве причины гибели рыб при низком рН воды, отдавая предпочтение повреждению ионных насосов и утечке ионов из организма.
Основанием для подобного вывода послужили результаты определения одного из показателей состояния газообмена — потребления кислорода тремя видами рыб (золотая рыбка, ушастый окунь и канальный сомик) при экстремально низком значении рН воды. Только у одного из 3 видов (канального сомика) Г. Ульч обнаружил снижение потребления кислорода при низком рН. Правда, уже тогда автор пришел к выводу, что значение гипоксии в качестве причины кислотного отравления и гибели рыб при низком рН нуждается в критической проверке с привлечением исследований динамики напряжения газов в крови рыб, что и сделано было в последующей работе, выполненной на безупречном методическом уровне. Важным дополнительным доказательством роли гипоксии как основной причины гибели карпа при летально низком уровне рН служит примерно равная продолжительность выживания рыб в условиях аноксии (4 ч) ив воде с рН 3,5 (5,2 ч) при максимальной оксигенации. Таким образом, снижение величины рН пресной воды в толерантном диапазоне с 7,4 до 5,1 оказывает незначительное влияние на водно-солевой обмен и кислотно-щелочное равновесие подопытных рыб, за исключением легко компенсируемого снижения щелочного резерва крови. Процессы поглощения и выведения ионов натрия идут примерно с одинаковой интенсивностью, и концентрация Na+ в крови остается более или менее постоянной. Дальнейшее понижение величины рН до сублетально го уровня (с 5,1 до 4,0) вызывает глубокие изменения кислотно-щелочного и ионного гомеостаза.
Конкретные механизмы возникающих при этом физиолого-биохимических нарушений остаются неясными, несмотря на обилие исследований, проводившихся в последние полтора десятилетия после открытия Р. Пакером и В. Дансоном феномена снижения концентрации натрия в крови вследствие угнетения его поглощения из внешней среды и увеличения диффузионных потерь. Уровень диффузионных потере натрия при снижении величины рН в значительной мере определяется концентрацией кальция в воде, и при искусственном его увеличении эти потери снижаются вследствие понижения межклеточной и клеточной проницаемости жаберного эпителия. В этом нет ничего неожиданного, ибо еще в начале 70-х годов было установлено, что проницаемость жаберного эпителия рыб для ионов натрия и хлора в значительной мере определяется концентрацией ионов кальция в воде. Снижение концентрации кальция до порогового уровня само по себе, без дополнительных стрессорных воздействий на организм, нарушает работу ионных насосов по транспорту солей, приводит к перестройке ультраструктуры клеток жаберного эпителия и влияет на пассивную утечку ионов из организма рыб. Иными словами, ионы кальция играют ведущую роль в определении скорости и масштабов диффузионных потерь натрия как в гипотонической среде, так и при снижении величины рН воды, т. е. при увеличении концентрации ионов водорода, а увеличение концентрации кальция в воде повышает устойчивость рыб. Из этого следует, что ионы водорода, увеличивая проницаемость жаберного эпителия и диффузионные потери ионов натрия, являются как бы антагонистами ионов кальция. Однако конкретные физиологические механизмы этого влияния остаются вне поля зрения исследователей, изучающих причины гибели рыб под влиянием остро токсичных концентраций Н+.
На передний план в качестве первопричины токсического действия низких рН выдвигается гипопротеинемия, т. е. снижение концентрации ионов натрия в крови рыб. Однако необходимо иметь в виду, что гипопротеинемия — это не причина, а следствие действия низких рН, в основе которого лежит, по-видимому, изменение концентрации внутриклеточного кальция, изменение физико-химических свойств структур, связывающих кальций в клетке или межклеточном пространстве, наконец, перераспределение и изменение удельного веса связанного и свободного кальция. Известно, что в клетке 99% кальция связано, и в обычных условиях концентрация ионов кальция в цитоплазме составляет порядка 10"7 — 10~8М, что создает предпосылки для использования свободного кальция в качестве регулятора различных внутриклеточных процессов. Регуляторные функции кальция проявляются при изменении его концентрации в цитоплазме уже в пределах долей одного мкмоль. Наконец, имеются прямые экспериментальные данные, полученные на клетках мочевого пузыря лягушки, свидетельствующие о том, что при изменении внутриклеточной концентрации кальция имеет место четко выраженное изменение осмотической проницаемости.
Словом, необходимо специальное изучение механизмов влияния высоких концентраций водородных ионов на обмен кальция, изменение его внутриклеточной и межклеточной концентрации, поскольку именно кальций играет ключевую роль в определении проницаемости жаберного эпителия для ионов, в том числе и ионов натрия, концентрация которого в крови при кислотном отравлении претерпевает заметные изменения.
