Материальные основы наследственности.
Разнообразие животных организмов как межвидовое, так и внутривидовое обусловлено разнообразием генетического материала. Это разнообразие может регистрироваться на разных уровнях. Одним из уровней изучения генетического разнообразия является цитологический.
Общие сведения о структурной организации хромосом и основные стадии митоза. Большинство существующих ныне представителей животного и растительного царств являются эукариотами, то есть организмами, в клетках которых сформировано обособленное ядро. Если геном прокариот объединен в единую кольцевую структуру, находящуюся непосредственно в цитоплазме, то у эукариот он сконцентрирован в ядре, где по особенностям морфологии и функционирования его можно разделить на несколько составляющих.
Структурно обособленные компоненты генома носят название хромосом. Основу их строения составляет двухцепочечная молекула ДНК, образующая сложную спираль в комплексе с белками. Хромосомы располагаются в ядре клетки и отделены от цитоплазмы ядерной мембраной. Несмотря на интенсивные исследования, длящиеся уже почти 100 лет, проблема структурно-функциональной организации хромосом эукариот до сих пор еще не решена.
Рисунок. 41. Уровни структурной организации эукариотической хромосомы: от двойной спирали ДНК до митотической хромосомы ленить несколько структурных уровней организации, из которых наиболее изученными являются первые три (рисунок 41).
Из этих трех уровней детально изученным можно считать только I. Организация более высоких структурных уровней до сих пор является предметом оживленных дискуссий. В течение жизни клетки хромосомы проходят через ряд состояний, соответствующих стадиям клеточного цикла. На этих стадиях они либо четко индивидуализированы и поддаются микроскопическому анализу, либо образуют клубок деконденсированных нитей и морфологически и морфологически не могут быть идентифицированы.
Период между делениями клеток, называемый интерфазой, является основным в их жизнедеятельности.
В интерфазе осуществляется функционирование генетического аппарата на основе процессов транскрипции и трансляции. На этой стадии хромосомы, как правило, невозможно увидеть с помощью светового микроскопа. В течение многих лет даже существовали сомнения в том, сохраняется ли в интерфазе линейная непрерывность хромосомы.
Более поздние электронно-микроскопические исследования интерфазных ядер показали, что в действительности непрерывность хромосом сохраняется, но хромосомная ДНК очень сильно деконденсируется и заполняет весь объем ядра в виде ультратонких нитей диаметром 20 — 30 нм. На этой стадии ДНК метаболически наиболее активна и служит матрицей для своей собственной репликации, а также для синтеза различных иРНК.
В интерфазе выделяют три периода:
- период G1 связан с активным синтезом РНК и белков;
- в S периоде происходит репликация ДНК хромосом и удвоение хромосомного набора клетки;
- период G2 завершает интерфазу и подготавливает клетку к делению.
В настоящее время известно, что центральную роль в процессах компактизации-декопмактизации хромосомного материала играют две группы белков: конденсины и когезины. Когезины связываются с ДНК непосредственно во время репликации и удерживают вместе сестринские хроматиды на протяжении всей интерфазы. Конденсины обеспечивают более плотную упаковку неактивных областей ДНК на стадии интерфазы, а также компактизацию хромосом при переходе к митозу. Хромосомы суд-военным генетическим материалом вступают в митоз, завершающий клеточный цикл и являющийся наиболее коротким его периодом.
С помощью светового микроскопа можно увидеть только митотические хромосомы, на этой стадии ДНК находится в состоянии метаболического покоя и не используется в качестве матрицы для какого-либо синтеза. Такая ДНК очень плотно упакована и находится в форме, наиболее удобной для распределения в дочерние клетки. В интерфазном ядре различных видов растений и животных можно увидеть половой хроматин, который выявляется в виде интенсивно окрашенных глыбок. Именно так осуществляется регуляторная компенсация дозы гена.
Существует очень широкий межвидовой полиморфизм, как по числу, так и по морфологическим признакам митотических хромосом. Считается, что не существует прямой связи между числом хромосом и степенью эволюционной продвинутости организмов. Например, представители разных систематических групп могут иметь одинаковое число хромосом (картофель и человек, 2п = 46).
Рисунок. 42. Схема образования поперечных дисков в политенных хромосомах: Изображен отрезок хромосомы, состоящий из 8 элементарных хромосом (степень политении 2). Узелки плотно компактизованного материала — хромомеров, присутствующих в каждой хроматиде, образуют поперечную полосу или диск
Интерфазные, политенные хромосомы.
В некоторых особых случаях интерфазные хромосомы можно наблюдать в световой микроскоп. Эти случаи связаны с исследованием политенных хромосом. Например, у насекомых отряда Diptera в некоторых тканях индивидуальные хроматиды остаются тесно связанными во время и после каждого цикла репликации (эндомитоз), что приводит к возникновению классических цитологических структур, называемых политенными хромосомами. Политенные хромосомы представляют собой случай полиплоидии, поскольку следующие друг за другом циклы репликации проходят без разделения множества образовавшихся хроматид. Эти хромосомы существуют постоянно в интерфазном состоянии. Такая ситуация создает возможность для прямого исследования природы и функции политенных хромосом.
Политенные хромосомы имеют вид длинных лент с отчетливыми полосами, образованными поперечными дисками, которые состоят из продольно соединенных между собой хромомер. Диски более интенсивно окрашиваются, по сравнению с междисками, и в электронном микроскопе выявляются как более плотные участки, возникающие вследствие локального увеличения плотности упаковки индивидуальных хроматиновых нитей в хромомерах (рисунок 42). Значение анализа структуры политенных хромосом определяется тем, что расположение дисков и их число строго постоянны и характерны для данного вида. Перестройки, приводящие к изменению числа и расположения дисков, часто коррелируют с различными изменениями фенотипа.
Рисунок. 43. Кариотип Chironomus pilicornis Fabr с n = 4. Цифры указывают подразделение хромосомных плеч на районы.
N — ядрышко, п — факультативное ядрышко. BR — кольцо Бальбиани. Центромерные районы указаны стрелками
Локализация соответствующих генов на генетической карте соответствует положению определенных дисков, что дает возможность сопоставлять генетические и цитологические карты (рисунок 43).
Цитогенетический анализ хромосом является необходимой частью современных полевых исследований природных популяций эукариотических организмов. Он позволяет уточнять систематическую принадлежность объекта исследования, выявлять внутривидовой полиморфизм на хромосомном уровне и оценивать влияние факторов окружающей среды на стабильность генетического материала.
Оборудование и сбор материала.
Сбор материала для цитогенетического анализа осуществляют традиционными методами в зависимости от конкретного объекта исследования. Для анализа собранного материала необходимо наличие рабочих мест, оборудованных микроскопами и стереомикроскопами, с посудой для приготовления и окрашивания цитологических препаратов, необходимыми химическими реактивами.
Симулид собирают в банку с пресной водой в ручьях, впадающих в море. Для обеспечения материалом последующих групп устанавливаются «ловушки». Для этого надламывают пучок травы около переката и опускают конец пучка в воду. Здесь же на литорали, во время отлива, в емкости с фиксатором собирают половозрелых самок рачков Jaera sp. Мотыля можно выловить в низовых болотистых озерах. В тех же водоемах можно собрать головастиков.
Щавель собирают по дорогам, ведущим к Бирже и Юшковской губе, и тут же фиксируют смесью метанола и ледяной уксусной кислоты в соотношении 3:1.
Приготовление препаратов политенных хромосом из слюнных желез симулид и мотыля. Слюнные железы личинок симулид и мотыля выделяют при помощи бинокулярного микроскопа. Для этого препаровальными иглами личинку переносят на предметное стекло в каплю физиологического раствора для насекомых. Все дальнейшие действия проводят в поле зрения микроскопа. Личинку декапитируют, стараясь не повредить структуру внутренних органов.
При правильно проведенной декапитации слюнные железы отделяются вместе с головой в виде парных, прозрачных и удлиненных (у симулид) или округлых (у мотыля) органов. При помощи препаровальных игл выделенные слюнные железы переносят в каплю 2 %-гб ацетоорсеина на 7 — 10 минут.
Окрашенные слюнные железы помещают в каплю 45 %-й уксусной кислоты и накрывают покровным стеклом. Чтобы удалить излишки уксусной кислоты, сверху накладывают бумажный фильтр. Затем материал давят легким прокатыванием по фильтру препаровальной иглы. Последнее можно заменить легким постукиванием по фильтру деревянной палочкой.
