Реакция Робина Хилла — показатель фотохимической активности хлоропластов
Одним из показателей фотохимической активности хлоропластов является реакция Хилла. Она представляет собой комплекс начальных стадий фотосинтеза, обусловленных фотоокислением воды. Фотовосстановление акцепторов сопровождается выделением кислорода:
где А - акцептор электронов.
Эта реакция была открыта Робин Хиллом в 1937 г., обнаружившим, что изолированные хлоропласты способны при освещении восстанавливать железо (Fe3+ → Fe2+), одновременно выделяя кислород.
В дальнейшем было показано, что хлоропласты могут восстанавливать и другие соединения: окислительно-восстановительные индикаторы, бензохинон, а также естественный акцептор электронов - NADP.
Ход работы
0,5 г свежих листьев растереть в ступке с фосфатным буфером рН 6,5, содержащим 0,08 М КС1. Растертую массу количественно буфером перенести в центрифужную пробирку, центрифугировать 10 минут при 3000 об/минуту. Осадок отбросить, надосадочную жидкость поместить в мерную колбу на 25 мл и буфером довести до метки. Опыт проводить при низких температурах.
2 мл раствора поместить в кювету спектрофотометра, добавить 2 мл раствора акцептора электронов. Определить оптическую плотность по исходному буферу.
В две сухие пробирки налить по 2 мл суспензии и по 2 мл акцептора электронов (феррицианид калия). Одну пробирку выставить на 15 минут на свет, а вторую (контрольную) на 15 минут поместить в темноту.
Через 15 минут определить оптическую плотность контрольной и опытной пробы. Разность между оптической плотностью контрольной и опытной пробы означает фотохимическую активность суспензии (А).
Фотосинтетическую активность хлорофиллов определить по формуле:
где А - фотосинтетическая активность;
D1 и D2 - оптические плотности обеих проб;
25 - объем надосадочной жидкости (мл);
2 - объем суспензии, взятой для проведения реакции (мл);
m - масса растительного материала (г);
15 - время экспозиции (мин).
Оборудование и реактивы:
Ступки фарфоровые, весы и разновесы, ножницы, колбы мерные на 25 мл, центрифуга, пипетки на 2 мл, пробирки, феррицианид калия (65мг/1000 мл Н2O), фосфатный буфер pH [Na2HPO4·2H2O 1/15 М (11,876 г/л) 3,5 мл + КН2РО4 1/15 М (9,078 г/л) 6,5 мл, фосфатный буфер: 10 мл буфера + 5,96 КОl.
Вопросы для повторения:
- Почему все работы нужно проводить при пониженных температурах?
- Какие существуют естественные акцепторы водорода?
