Реакция Р. Хилла. Определение интенсивности фотосинтеза газометрическим методом (по Бабушкину Л.).
Одним из показателей фотохимической активности хлоропластов является реакция Хилла. Она представляет собой комплекс начальных стадий фотосинтеза, обусловленных фотоокислением воды. Фотовосстановление акцепторов сопровождается выделением кислорода:
>
где А- акцептор электронов.
Эта реакция была открыта Робин Хиллом в 1937 г., обнаружившим, что изолированные хлоропласты способны при освещении восстанавливать железо
, одно
временно выделяя кислород.
В дальнейшем было показано, что хлоропласты могут восстанавливать и другие соединения: окислительно- восстановительные индикаторы, бензохинон, а также естественный акцептор электронов - NADP.
Ход работы
0,5 г свежих листьев растереть в ступке с фосфатным буфером рН 6,5, содержащим 0,08 М КС1. Растертую массу количественно буфером перенести в центрифужную пробирку, центрифугировать 10 мин. при 3000 об/мин. Осадок отбросить, надосадочную жидкость поместить в мерную колбу на 25 мл и буфером довести до метки. Опыт проводить при низких температурах.
2 мл раствора поместить в кювету спектрофотометра, добавить 2 мл раствора акцептора электронов. Определить оптическую плотность по исходному буферу.
В две сухие пробирки налить по 2 мл суспензии и по 2 мл акцептора электронов (феррицианид калия). Одну пробирку выставить на 15мин. на свет, а вторую (контрольную) на 15 мин поместить в темноту.
Через 15 мин определить оптическую плотность контрольной и опытной пробы. Разность между оптической плотностью контрольной и опытной пробы означает фотохимическую активность суспензии (А).
где А- фотосинтетическая активность; D| и D2 - оптические плотности обеих проб; 25 -объем надосадочной жидкости (мл);
Фотосинтетическую активность хлорофиллов определить но формуле:
2 - объем суспензии, взятой для проведения реакции (мл);
ш - масса растительного материала (г);
15 - время экспозиции (мин).
Оборудование и реактивы:
Ступки фарфоровые, весы и разновесы, ножницы, колбы мерные на 25 мл, центрифуга, пипетки на 2 мл, пробирки, феррицианид калия (65мг/1000 мл Н20), фосфатный буфер рН [Na2HP04-2H20 1/15 М (11,876 г/л) 3,5 мл + КН2Р04 1/15 М (9,078 г/л) 6,5 мл, фосфатный буфер: 10 мл буфера + 5,96 KCIJ.
Вопросы для повторения:
- Почему все работы нужно проводить при пониженных температурах?
- Какие существуют естественные акцепторы водорода?
Определение интенсивности фотосинтеза газометрическим методом (по Бабушкину Л.).
Интенсивность фотосинтеза выражает количество поглощенного СО2 (мг) или выделенного Ch (мг) в единицу времени (час) на единицу площади листовой поверхности (дм).
Интенсивность фотосинтеза зависит от освещенности, температуры воздуха, содержания С02 и 02 и т.д. В течение дня могут наблюдаться 2-3 максимума интенсивности фотосинтеза. Интенсивность фотосинтеза увеличивается одновременно с увеличением концентрации С02 и проходит в оптимальных условиях, когда лист содержит 86% воды. В условиях засухи интенсивность фотосинтеза снижается на 80-90%. Недостаток минеральных элементов также резко снижает интенсивность фотосинтеза.
Интенсивность фотосинтеза может быть определена по количеству накопленного сухого вещества, однако самый распространенный метод состоит в определении количества поглощенного С02.
Процесс этот основывается на использовании буферных растворов Варбурга, способных поддерживать над раствором определенную концентрацию С02.
Для определения интенсивности фотосинтеза применяется прибор, предложенный JI.H, Бабушкиным (рис.8).
Ход работы
На две колбы объемом 100 мл (контрольная и опытная) надеть белые чехлы из бумаги для предохранения системы от нагревания, прилить в каждую по 20 мл буферного раствора (1,5 Na2C03 + 14 NaHC03 на 1000 мл воды). Контрольную колбу закрыть резиновой пробкой, на опытную надеть зажим Бабушкина, между кольцами которого помещен лист исследуемого растения (нижней стороной лист направлен внутрь колбы). Опыт проводится в двух повтор- ностях (т.е. на одном растении ставят опыт дважды).
Установка для определения интенсивности фотосинтеза (по Бабушкину Л.).
Контрольная колба стоит рядом с опытой, т.е. находится в тех же условиях. Экспозиция - I час. При этом С02 из буферного раствора поглощается листом для осуществления процесса фотосинтеза.
После экспозиции слить обе контрольные колбы в одну и обе опытные колбы в одну (установление средней пробы). В обе колбы прибавить по 7 мл 0,025 н раствора НС1. Определить оптическую плотность контрольного и опытного растворов по исходному буферу на ФЭКе. По найденным оптическим плотностям найти на калибровочной кривой концентрацию С02 в опытной (а) и контрольной (б) колбах.
у
где:
а - концентрация С02 в опытной колбе;
b - концентрация С02 в контрольной колбе;
t - время опыта, в часах;
13,8- площадь отверстия насадки зажима Бабушкина, в дм2.
При колориметрировании используется зеленый светофильтр и кювета на 20 мл (рис.8, Д-520-530 нм).
Оборудование и реактивы:
Зажим Бабушкина, колбы на 100 мл с пробками в чехлах (внизу черный, сверху белый), дозатор, пипетка на 5 мл, ФЭК-М, буферный раствор, НС1 0,025 н, фенолфталеин 1%.
Вопросы для повторения:
- Как определить интенсивность фотосинтеза?
- Какие факторы влияют на интенсивность фотосинтеза?
- У каких растений более интенсивный фотосинтез: Сз- типа или Сд?
