В биологическом плане первостепенный интерес представляет вопрос об адаптационном характере биохимического полиморфизма ферментов рыб.
Не приходится сомневаться в том, что выявленные различия в электрофоретической подвижности отдельных вариантов ферментов определяются изменениями первичной структуры белка, которая находится под жестким генетическим контролем. Появление новых вариантов ферментов и их закрепление в геноме путем отбора полезных возможно лишь при длительных (в течение жизни многих поколений) изменениях температурного или любого другого фактора. Эти измененные условия должны стать "фактом" генетической информации, т. е. привести к изменению последовательности оснований в ДНК, а затем уже в результате транскрипции и трансляции материализоваться продуцированием нового фермента, более адаптированного к изменившимся условиям.
Вполне понятно, что приобретение новой генетической информации, детерминирующей новые адаптивные фенотипические признаки, в том числе и появление новых вариантов ферментов (изо и алло), — это процесс длительной эволюционной адаптации организма к постоянно колеблющимся факторам внешней среды.
Исходя из этих теоретических предпосылок можно было предвидеть адаптивную природу эволюционных преобразований белков, в том числе и адаптивное значение появления новых вариантов того или иного фермента у отдельных видов и их популяций. Между тем в конце 60-х начале 70-х годов адаптивная природа биохимического полиморфизма ферментов была подвергнута критике сторонниками "нейтралистской" гипотезы эволюции. По их мнению, эволюция белков совершается путем случайной замены одних аллелей другими вследствие взаимодействия мутационного процесса и дрейфа генов. Роль отбора либо вообще отрицается, либо признается его второстепенное значение. Эта точка зрения встретила обоснованную критику. Многочисленные данные по биохимическому полиморфизму ферментов, полученные при обследовании природных популяций, а также ряд экспериментальных данных о роли изоферментов в акклимации и адаптации рыб к температурному фактору не подтверждают основное допущение "нейтралистской" гипотезы о случайной фиксации аллелей и, следовательно, нейтральном характере полиморфизма ферментов.
Как показали целенаправленные исследования В. С. Кирпичникова и многих других исследователей, генетические различия по локусам ферментов имеют, несомненно, адаптивную природу. Об этом же свидетельствуют и данные по механизмам биохимической адаптации рыб к факторам внешней среды. Между изо и аллоформами ферментов существуют четко выраженные функциональные различия (различное сродство к субстратам, устойчивость к изменению температуры). Наконец, смена изоферментов в процессе индивидуального развития и при сезонных перестройках метаболизма также свидетельствует об адаптивной природе полиморфизма ферментов.
Принципиальное значение в этом плане имеют данные по избирательному синтезу отдельных изоферментов, адаптированных (имеющих минимальные К ) к тому или иному температурному диапазону.
Это так называемые сезонные изоферменты, обнаруженные в начале 70-х годов П. Хочачкой и другими авторами на примере ацетилхолинэсте разы головного мозга радужной форели. Этот фермент представлен двумя изоферментами, один из которых синтезируется при акклимации к 2°С, а другой — при акклимации к 17°С. При умеренной для этого вида температуре (12°С) синтезируются оба изофермента. Это замечательный пример сезонного включения и выключения синтеза ферментов, адаптированных к конкретному температурному режиму. "Теплый" и "холодный" изоферменты ацетилхолинэстеразы имеют четко выраженные кинетические различия, обусловленные различной степенью сродства фермента к субстрату (рисунок 14) — оптимальной для конкретного температурного режима.
Специальное изучение этого вопроса показало, что в разное время года синтезируются различные варианты фермента: один из них, имеющий более высокую электрофоретическую подвижность, образуется при 18°С, а другой, с меньшей электрофоретической подвижностью — при 4°С. Величина К соответствует температурам их синтеза. Иными словами, регуляторные механизмы, управляющие синтезом ацетилхолинэстеразы, обеспечивают мозг форели именно тем вариантом фермента, который необходим для эффективной работы в конкретных температурных условиях того или иного сезона года.
При крайних (зимних или летних) температурах полностью выключается синтез ненужного в данных условиях изофермента, а при умеренных переходных температурах синтезируются оба варианта фермента, увеличивая тем самым резервный адаптационный потенциал.
Это один из двух основных путей биохимической адаптации к сезонным изменениям температуры, когда происходит попеременное включение и выключение генов, кодирующих тот или иной вариант фермента.
Другой, по-видимому, более распространенный путь биохимической адаптации к длительным (сезонным) колебаниям температуры заключается в постоянном синтезе набора изоферментов, каждый из которых адаптирован к работе в определенных температурных интервалах. Здесь возможны сезонные сдвиги лишь в количественном соотношении отдельных вариантов фермента. Примером может служить изоцитратдегидрогеназг печени радужной форели, которая представлена у различных особей одного из питомников тремя изоферментами: А2, В2 и С2.
Обнаружена сезонная изменчивость частоты встречаемости рыб, имевших только изофермент А2 — 30% в зимней выборке и 23% — в весенней выборке. У особей, имевших только изофермент 12, не обнаружено положительной температурной модуляции (рисунок 15), а у рыб, имевших все три изофермента, выявлено четко выраженное компенсаторное снижение сродства к ферменту при температурах выше 10°С. По-видимому, особи, имеющие все три изофермента, получают определенные преимущества перед рыбами с одним изоферментом, поскольку активность изоцитратдегидрогеназы у них в летний период меньше зависит от температуры.
Рисунок 14. Влияние температуры на сродсродство к ацетилхолину ацетилхоство к субстрату (ДЛ-изо цитрату) разлинэстераз четырех видов рыб.
I, II — радужная форель; III - Trematomus borchgrevinki; IV — кефаль (Mugil cephalus); V — элопс (Elops hawaieusis).
Рисунок 15. Влияние температуры на сродство к субстрату (ДЛ-изоцитрату) различных изоферментов изоцитратдегидрогеназы радужной форели.
В печени форели обнаружены 2 изофермента цитратсинтазы. В скобках указана температура, при которой адаптирован или акклимирован данный вид вый" и "тепловой". Сродство этих изоферментов к субстрату (Км) при 15°С примерно одинаково, однако при более высоких температурах «м "холодового" фермента становится значительно больше (сродство снижается), чем у "теплового" изофермента.
Исследование природных популяций рыб дало много примеров существования географической клины по частотам аллелей, кодирующих различные изоферменты.
Одно из первых наблюдений проведено на видах рода Catastomus. У близких видов, обитающих на севере, обнаружен только один "северный" аллель гена, кодирующего ЭСТ. Концентрация аллеля ЭСТа у Catastomus clarcii на севере Американского побережья Атлантического океана составляла 0,18, а на юге доходила до 1,00. Сходная направленность изменения концентрации одного из аллелей ЭСТ выявлена в популяциях арктического гольца (Salvelinus alpinus): от 0,17 на севере до 1,00 на юге. Экологическая обусловленность клйнальной изменчивости частот аллелей ЛДГ выявлена у нерки. Показано, что "северный" аллофермент ЛДГ-Й! активен при низких температурах и термолабилен, а "южный", напротив, обладает более высокой активностью при повышенных температурах и термостабилен. Широтные различия по двум формам ЛДГ печени обнаружены у карпозубой рыбы Fundulus heteroclitus. Кинетические исследования подтвердили адаптивную природу географического полиморфизма изоферментов ЛДГ: вариант ВВ лучше функционирует при пониженных, а вариант В'В' — при повышенных температурах. Относительная активность тканевой ЛДГ у серебряного карася и ушастого окуня при температурной акклимации не изменяется, но отбор по этому признаку, связанный с географическими условиями, имеет место в природных популяциях.
Сезонная смена набора изоферментов, или постоянный синтез различных вариантов фермента, каждый из которых наиболее эффективно работает при том или ином температурном режиме, представляют собой важнейший механизм компенсаторной биохимической адаптации к длительным (сезонным) колебаниям факторов внешней среды. Сезонная смена изоферментов особо важна в тех случаях, когда отрицательная температурная модуляция имеет место при изменении температуры в толерантном диапазоне. Логично думать, что сезонная смена изоферментов более вероятна для тех катализаторов, которые проявляют высокую чувствительность Ки к температуре и особенно к отрицательной температурной модуляции. Однако у рыб, имеющих высокополиморфные ферменты, представленные несколькими вариантами, каждый из которых приспособлен к работе в определенном температурном интервале, отпадает необходимость сезонной смены синтезируемых ферментов (ЛДГ, МДГ) форели.
Наконец, еще один путь биохимической адаптации — это выработка гомологичных ферментов, для которых характерна более или менее выраженная независимость от изменений температуры в толерантном для вида диапазоне. Яркий пример такого рода адаптации дает нам пируваткина за Gilichthys mirabilis (рисунок 16), способность которой связывать фосфоенол-пируват (субстрат) практически не зависит от температуры в довольно значительном диапазоне. Это пример выработки эвритермного фермента, существенно отличающегося по степени температурной зависимости К в сравнении со стенотермными изоферментами пируваткиназы радужной форели.
К сожалению, изучение изоферментов и аллоферментов в эколого-биохимическом аспекте, т. е. для понимания их роли и удельного веса в биохимической адаптации к различным условиям обитания, существенно отстает от генетических исследований, что нельзя признать нормальным по двум причинам:
- Во-первых, конкретному использованию той или иной изо-ферментной системы в популяционно-генетических работах должно предшествовать изучение возрастной и сезонной изменчивости этих систем.
- Во-вторых, и это главное, полиморфизм ферментов это, по-видимому, один из важнейших эколого-биохимических механизмов как компенсаторной, так и эксплуатационной адаптации различного временного масштаба.
С этих позиций логично выглядит гипотеза о большей стабильности ферментов у стенотермных видов рыб и большей генетической изменчивости ферментов у эвритермных рыб, живущих в условиях, так сказать, непредсказуемого температурного режима, хотя, разумеется, в этом правиле будут исключения.
Полученные к настоящему времени данные показывают, что наиболее выраженная степень полиморфизма характерна для ферментов, катализирующих практически необратимые реакции.
Рисунок. 16. Влияние температуры на сродство трех видов рыб:
I, II — радужной форели Salmo gaird- neri; III - GiKchthys mirabilis; IV — Trematomus borchgrevinki. В скобках указана температура, к которой адаптирован или акклимирован данный вид важную регуляторную роль, а потому, вероятно, в большей степени подвержены влиянию естественного отбора.
Следует особо подчеркнуть, что первичная структура белка далеко не единственный фактор, определяющий его функциональные свойства, особенно если речь идет о ферментах.
В этом плане чрезвычайно интересна проблема "мгновенных изоферментов", т. е. конформационных вариантов того или иного фермента, сформулированная П. Хочачкой и Дж. Сомеро. Быстрые изменения факторов внешней среды не оставляют организму времени для введения информации об этих изменениях в геном и синтеза новых вариантов макромолекул, или для перестроек в системе управления транскрипцией. В этих условиях подчас невозможна даже избирательная активация генов для синтеза новых ферментов из тех, что уже закодированы в геноме, и остаются только механизмы модуляционной стратегии.
Один из них это — мгновенное изменение конформации белка под влиянием температуры, оказывающей прямое воздействие на слабые связи (ионные, водородные, гидрофобные), поддерживающие макромолекулярную структуру высшего порядка (четвертичную). Благодаря этим изменениям могут возникать конформационные изомеры (конформеры), т. е. функциональные изоферменты, которые при мгновенном понижении или повышении температуры выполняют функции, аналогичные "тепловым" и "холодовым" изоферментам.
Теоретически обоснованные предположения о возможности существования мгновенных изоферментов подтверждены на примере пируваткиназной системы камчатского краба Paralitodes camtschatica, которая является функциональным аналогом пируваткиназной системы радужной форели.
Еще один механизм мгновенной компенсаторной биохимической адаптации, включающийся при быстрых и кратковременных изменениях температуры, — это положительная температурная модуляция, стабилизирующая работу фермента, а также изменение микросреды, в которой функционирует данный фермент, оказывающей влияние на его каталитические и регуляторные свойства с помощью положительных и отрицательных модуляторов (водородные ионы, неорганические ионы молекулы, которые входят в фермент неотъемлемой составной частью).
Так, например, составной частью многих ферментов окислительного метаболизма в митохондриях являются липиды. Один из этих ферментов - сукцинатдегидрогеназа серебряного карася — проявляет выраженные компенсаторные изменения активности при акклимации к пониженным (5 С) и повышенным (25°С) температурам. Установлено, что белковая часть очищенных от липидных компонентов "теплового" и "холодового" изоферментов оказалась одинаковой (по электрофоретической подвижности). Однако степень активации очищенного белка сукцинатдегидрогеназы очищенными липидами из митохондрий рыб, акклимированных к двум крайним температурам, была существенно различной: липиды от рыб, акклимированных к низким температурам, активизировали белковую часть фермента значительно сильнее, чем от рыб, акклимированных к высоким температурам. Следовательно, у ферментов, имеющих пятиричный уровень структуры (связанные с мембранами), акклимация к теплу или холоду может в значительной мере определяться изменениями липидной части фермента. Специальные опыты показали также, что уровень активации белковой части ферментов липидами обычно прямо пропорционален степени их ненасыщенности.
Теоретически возможны и другие механизмы модуляционной стратегии немедленной биохимической адаптации к быстро наступающим изменениям температуры.
Хорошо известна, например, выраженная зависимость активности ферментов от ионного состава микросреды, в которой работают ферменты, в первую очередь от концентрации ионов Н+, а также Мд2+, К, Na+. Например, эффективная работа фермента, активируемого ионами Мд2+, при снижении температуры может сохраняться за счет повышения внутриклеточных концентраций этого иона. Любые изменения температуры, приводящие к изменению величины рН, также могут оказывать влияние на активность фермента.
Таким образом, под влиянием колебаний температуры воды в организме рыб возникают различные по направленности, интенсивности и латентному периоду компенсаторные биохимические изменения на тканевом, клеточном и молекулярном уровнях, обеспечивающие сохранение, если это возможно, метаболического гомеостаза.
Молекулярные механизмы температурной адаптации включают в себя изменения первичной структуры ферментов, с помощью таких фундаментальных механизмов, как активация генов, транскрипция, трансляция и сборка новых вариантов ферментов (изоферментов), изменение концентраций отдельных изоферментов, приспособленных к определенным температурам, изменение кинетических свойств данного фермента, изменение кофакторов и микросреды, в которой функционируют ферменты, конформационные изменения, ведущие к появлению "мгновенных", или функциональных, изоферментов.
Выбор стратегии и конкретных механизмов биохимической адаптации рыб определяется прежде всего скоростью наступления и длительностью сохранения температурных изменений, а также видовыми экологическими и возрастными особенностями рыб.
