Построение калибровочной кривой для количественного определения белка по биурету.

Ход работы

В шесть пробирок ввести соответствующий объем жидкости, указанный в таблице, постоянно взбалтывая раствор. По истечении 30 мин. определить оптическую плотность на КФК - 3 при длине волны 540 нм. Полученные результаты используют для построения калибровочной кривой: на оси абсцисс отмечают содержание белка (мг/мл), на оси ординат - оптическую плотность.

Оборудование и реактивы:

КФК - 3; штатив с пробирками; пипетки градуированные на 1-2 мл; микробюретки; баллон с котой на 11; смери: 10% гидроокись Na, которая не содержит карбоната Na (75% смесь гидроокиси Na, в ней карбонаты не растворяются^, растворяется дистиллированной водой до 10% концентрации), реактив биурет (к 250 г дистиллированной воды добавляют 0,75 г сульфата меди и 3 г сегнетовой соли - нитрат Na - К, затем хорошо взбалтывают и добавляют 150 мл 10%, смеси гидроокиси Na и 1г йодага К. Объем доводят дистиллированной водой до И. Реактив содержится в полиэтиленовом,сосуде), стандартная смесь содержит 10 мг белКа в 1 мл..

Дозирование белков биуретовым методом.

Метод основан на образовании в щелочной среде соединения фиолетового цвета. Интенсивность окрашивания прямо пропорциональна концентрации белка в, пределах 2- 10 мг белка в пробе.

Ход работы 

К 1 мл разбавленного белка прибавляют 4 мл биуретно- го реактива, хорошо перемешивают и определяют оптическую плотность на фотоколориметре. Содержание белка в исследуемом материале рассчитывают по калибровочной кривой, в процентах, с учетом разведения.

Оборудование и реактивы:

Реактивы те же, что и в работ е 36. Раствор растительного белка разбавляют 5 %-ным раствором NaCl, а - нафтолом, так, чтобы содержание белка было в пределах 1-10 мг/мл.

Работа 39 Определение содержания ДНК по окрашиванию дезоксирибозы (по Дишу)

Метод определения содержания ДНК основывается на свойстве дезоксирибозы образовывать с фенилаланином соединение синего цвета. Рибоза и РНК не препятствуют определению ДНК.

Ход работы

0,1- 0,5 г измельченного материала количественно переносят 0,5 н раствором НСЮ4.. Пробирку соединяют с прямым холодильником и помещают на 30 мин. на водяную баню для экстрагирования нуклеиновых кислот и их гидролиза до образования растворимых ферментов. Гидролизат охлаждают, центрифугируют и используют для определения ДНК.

Берут 1-2 мл гидролизата, добавляют двойной объем реактива Диша. Смесь нагревают в течение 10 мин. на водяной бане. Смесь окрашивается в синий цвет. После охлаждения определяют оптическую плотность при Х= 600 нм. Если раствор сильно окрашен, тогда его разбавляют в 2 раза реактивом Диша. Содержание ДНК рассчитывают по калибровочной кривой. Для построения калибровочной кривой используется стандартный раствор ДНК.

Оборудование и реактивы:

Центрифужные пробирки на 25-50 мл; холодильник; реактив Диша (1г дифенилаланина, дважды перекристаллизованного в собственном растворе в 70% этиловом спирте, растворяют в 100 мл концентрированной уксусной кислоты и добавляют 2,75 мл концентрированной серной кислоты); стандартный раствор ДНК (0,1-1,0 мг/мл); раствор 0,2 н и 0,5 н перхлорной кислоты.

Термины.

Амилаза - фермент, под действием которого в растениях происходит расщепление крахмала. При этом образуются декстрины и мальтоза. Обнаружены три амилазы: а-амилаза, Р-амилаза и глюкоамилаза. Амилазы отличаются между собой по своему действию на крахмал и распространению в природе. При одновременном действии а- и р-амилазы крахмал гидролизуется на 95%.

Жирные кислоты - карбоксильные кислоты, входящие в состав лигшдов. Жирные кислоты бывают насыщенными и ненасыщенными. В растениях чаще всего присутствуют ненасыщенные жирные кислоты: олеиновая (80% в семенах масличных растений), линолевая и пальметиновая.

Крахмал - полисахарид, откладывающийся в виде зерен в клубнях, корнях и семенах растений. Содержание его в пшенице - 75%, кукурузе - 72%, рисе - 80%, картофеле - 12-14%. Крахмальные зерна состоят из амилозы (растворенная внутренняя часть - 20%) и амилопектина (труднорастворимая часть -80%), отличающихся по структуре и свойствам в зависимости от вида растений и условий среды.

Белки - макромолекулярные органические вещества, состоящие из аминокислот, соединенных пептидными связями. Они играют основную роль в жизни всех живых организмов. Выполняют как структурную, гак и запасную функцию.

Гемицеллюлоза - полисахарид, который не растворяется в воде, но растворяется в щелочах. Больше всего гемицеллю- лозы в древесной части растения, в соломе, семенах, орехах, кукурузных початках, отрубях и др. При кислотном гидролизе образуются манозы, галактозы, арабинозы, ксилозы.

Жиры - растительные масла, запасные вещества которых откладываются в больших количествах в семенах и фруктах. Так, соя содержит 20% жиров, подсолнечник - 24- 48%, клещевина - 60%, хлопок - 23%, кукуруза - 5%, горох, фасоль - 2%. По химической природе жиры представляют собой сложные эфиры глицерина и жирных кислот.

Запасные вещества - химические соединения, откладывающиеся в растительных клетках в качестве запасных веществ. Они не участвуют в физиологических процессах, но используются по мере необходимости. К запасным веществам относятся углеводы, белки и жиры. По количеству содержания запасных веществ растения делятся на 3 группы: масличные, крахмальные и белковые.

Липазы - ферменты, способствующие гидролизу жиров с образованием глицерина и жирных кислот.

Углеводы - соединения, состоящие из углерода, водорода и кислорода. По химической природе углеводы - это альдегиды и кетоны многоатомных спиртов, имеющие большое биологическое значение. Синтезируются в процессе фотосинтеза и являются промежуточными продуктами многих метаболитических процессов. Углеводы входят в состав структурных соединений растительной клетки. Они делятся на моносахариды (глюкоза, фруктоза), олигосаха- риды (сахароза, мальтоза, лактоза) и полисахариды (крахмал, целлюлоза).

Добавить статью в закладки