|
Газометрический метод определения активности пероксидазы. Определение содержания аскорбиновой кислоты в растениях.
Пероксидазы катализируют окисление органических соединении в растительной клетке (полифенолов, ароматических аминов и др.) с помощью пероксида водорода. С перок- сидом водорода пероксидаза образует комплексное соединение, в результате чего пероксид активируется и приобретает способность действовать в качестве акцептора водорода.
где АИ.2 - субстрат.
Активность пероксидазы определяется по скорости выделения кислорода. Прибор для определения активности пероксидазы состоит из закрепленной в штативе бюретки, к нижнему концу которой резиновой трубкой присоединена стеклянная груша, а на верхний конец надета пробка с тройником. Один конец тройника резиновой трубкой соединен с колбой на 50 мл, второй закрыт винтовым зажимом. Груша фиксируется на штативе в кольце. Бюретка и груша заполнены подкрашенной водой. Груша служит для установления уровня воды в бюретке на 0 (рис.9).
Ход работы
Навеску растительной ткани (0,2-0,3 г) растирать в фарфоровой ступке в течение 3 мин. с 2-Змл буферного раствора с рН = 6,2. Растертый материал перенести в большое колено ка- талазника, ступку несколько раз промыть буферным раствором с рН=6,2 (объем буферного раствора - до 13мл).
В малое колено каталазника поместить 2 мл 1,5% раствора Н2О2 и 2 мл 2,5% раствора пирогалола.
Соединить колбу с прибором, открыть зажим и перемещением груши установить уровень воды в бюретке на 0, затем закрыть зажим.
Перевернуть пробирку в колбе так, чтобы Н202 попала на навеску и, встряхивая колбу, отмечать каждую минуту уровень воды в бюретке (он снижается за счет давления кислорода). Во время отсчета уровень воды в груше и бюретке выравнивают. Определение проводят в течение 15 мин с интервалом в 3 мин.
Опыт проводится по изложенной выше методике.
Прибор для газометрического определения каталазы
Результаты опыта можно выразить в см3 02/100 г растительной ткани/ 15мин. и занести в таблицу:
|
Виды растений |
Навеска, г |
Объем выделившегося кислорода (мл) в течение |
Активность пе- роксидазы |
|
3 мин. |
6 мин. |
9 мин. |
12 мин. |
15 мин. |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
Оборудование и реактивы:
Ступки, растительное сырье (картофель, морковь и др.), прибор для определения активности каталазы (каталазник), СаСОз, 3%-ный раствор Hj02.
Вопросы для повторения:
- Какими методами определяется активность пероксидазы?
Определение содержания аскорбиновой кислоты в растениях.
Аскорбиновая кислота (витамин С) и глутатион широко распространены в растениях. Они являются дополнительной окислительной системой в растении.
Аскорбиновая кислота - неустойчивое соединение, способное к обратимому окислению и восстановлению под действием фермента аскорбатоксидазы (Е). Это медьсодержащий белок (0,24% меди).
1 лутатион представляет трипептид, состоящий из остатков глутаминовой кислоты, цистеина и гликокола.
Аскорбиновая кислота и глутатион - сильные восстановители, и их окислительно-восстановительные превращения в растениях осуществляются совместно.
Место аскорбиновой кислоты в ЭТЦ дыхания
Организм человека не способен синтезировать витамин С и обязательно должен получать его с пищей.
Ход работы
Свежий растительный материал растирают в ступке до извлечения сока.
В присутствии крахмала йод дает характерное синее окрашивание. Аскорбиновая кислота восстанавливает йод, и если ее достаточно, то раствор обесцвечивается.
- а) Набираем в первую колбу реактивы, указанные в таблице, раздел 1, колба 1. Если при добавлении 5-10 капель исследуемого сока содержимое колбы не обесцветилось, количество аскорбиновой кислоты меньше 5 мг%. Если же содержимое обесцветилось, количество аскорбиновой кислоты больше 5 мг%.
- б) Набираем во вторую колбу реактивы, указанные в таблице, раздел 1, колба 2. Если при добавлении 5-10 капель исследуемого сока содержимое колбы не обесцветилось, количество аскорбиновой кислоты составляет 5-10 мг%. Если же содержимое обесцветилось, количество аскорбиновой кислоты больше 10 мг%.
- в) Набираем в третью колбу реактивы, указанные в таблице, раздел 1, колба 3. Если при добавлении 5-10 капель исследуемого сока содержимое колбы не обесцветилось, количество аскорбиновой кислоты составляет 10-20 мг%.
Если же содержимое обесцветилось, количество аскорбиновой кислоты больше 20 мг%.
- г) Набираем в четвертую колбу реактивы, указанные в таблице, раздел 1, колба 4. Если при добавлении 5-10 капель исследуемого сока содержимое колбы не обесцветилось, количество аскорбиновой кислоты составляет 20-30 мг%. Если же содержимое обесцветилось, количество аскорбиновой кислоты больше 30 мг%.
Далее определение аскорбиновой кислоты проводим аналогичным образом, используя разделы II и III таблицы.
Таблица 1
|
Раздел |
№ колбы |
Аскорбиновая кислота, мг% |
CuSCV 5Н20 0.046% |
KI 1% |
Крахмал 0,15% |
|
I |
1 |
5 |
1 |
1 |
4 |
|
|
2 |
10 |
2 |
2 |
4 |
|
|
3 |
20 |
4 |
4 |
4 |
|
|
4 |
30 |
6 |
6 |
4 |
|
|
|
Аскорби |
|
|
|
|
Раз |
№ |
новая |
CuS04*5H20 |
KI |
Крахмал |
|
дел |
колбы |
кислота, |
0,09% |
2% |
0,3% |
|
|
|
мг% |
|
|
|
|
П |
1 |
10 |
1 |
1 |
4 |
|
|
2 |
20 |
2 |
2 |
4 |
|
|
3 |
40 |
4 |
4 |
4 |
|
|
4 |
60 |
6 |
6 |
4 |
|
Раз |
№ колбы |
Аскорбин. кислота, мг% |
CuS04* 5Н20 |
KI |
Крахмал 1,5% |
н2о |
|
дел |
0,465% |
10% |
|
III |
1 |
50 |
1 |
1 |
4 |
14 |
|
|
2 |
100 |
2 |
2 |
4 |
12 |
|
|
3 |
200 |
4 |
4 |
4 |
8 |
|
|
4 |
300 |
6 |
6 |
4 |
4 |
Обычно содержание аскорбиновой кислоты в растительных объектах составляет не более 40 мг%. Полученные результаты заносим в таблицу.
|
Вид растений |
Содержание аскорбиновой кислоты |
Выводы |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
Оборудование и реактивы:
Колбы конические на 50 мл, пипетки с делениями на 10 мл, 5 мл, цилиндр мерный на 25 мл, ступки, главные пипетки, CuS04- 5Н20 0,096%, 0,09%, 0,465%, KI 1%, 2%, 10%, крахмал 0,15%, 0,3%, 1,5%.
Вопросы для повторения:
- К какому классу ферментов относится каталаза, пероксидаза, аскорбатоксидаза?
- Каким свойством обладают эти ферменты?
Похожие статьи:
Добавить статью в закладки
|
